02 de junio de 2018
Aceptado: 22 de octubre de 2018

Resumen

El cáncer de próstata es la segunda enfermedad más diagnosticada en hombres a nivel mundial, con una tasa de mortalidad creciente en los últimos años. Actualmente, se cuenta con dos pruebas de detección temprana: la medición de los niveles en sangre del antígeno prostático específico y el tacto rectal de la próstata. Sin embargo, estas pruebas no presentan óptima especificidad y sensibilidad para su detección. Aunque diferentes estudios han buscado nuevos biomarcadores mediante la implementación de tecnologías, como secuenciación de nueva generación, espectrometría de masas, entre otras, aún persisten las mismas desventajas, por lo que no les ha permitido a estos su uso en la práctica clínica; razón por la cual, el descubrimiento de nuevos biomarcadores para el diagnóstico de cáncer de próstata, constituye un desafío para la comunidad científica.

Los prostasomas corresponden a vesículas extracelulares secretadas por el tejido prostático normal o tumoral que pueden ser detectadas en diferentes fluidos. Estructuralmente, los prostasomas difieren de otros exosomas, por su tamaño, composición de membrana y contenido específico de proteínas, lo que los convierten en una fuente potencial y novedosa de biomarcadores clínicos.

En este contexto, esta revisión presenta un panorama general de los biomarcadores proteicos, aislados desde prostasomas presentes en diferentes fluidos biológicos, para el posible diagnóstico de cáncer de próstata. Para ello se realizó una búsqueda sistemática en PubMed para estudios en proteómica para cáncer de próstata, con criterios como: vesículas extracelulares, exosomas y prostasomas, asimismo, sangre, orina, líquido seminal, entre otras muestras biológicas.

Abstract

Prostate cancer is the second most diagnosed disease among men worldwide, with a growing mortality rate in recent years. Currently, two methods can be used for early detection: prostate-specific antigen blood tests and digital rectal exams. However, their specificity and detection sensitivity are not optimal. Although several studies have searched for new biomarkers by implementing technologies such as next-generation sequencing and mass spectrometry, the same disadvantages persist. For that reason, biomarkers are not allowed in clinical practice and, therefore, discovering new ones to diagnose prostate cancer is a challenge for the scientific community.

Prostasomes are extracellular vesicles secreted by healthy or tumoral prostatic tissue that can be detected in different fluids. Prostasomes are different from other exosomes in size, membrane composition, and specific protein content, which makes them a potential and novel source of clinical biomarkers.

In such context, this review article presents a general overview of protein biomarkers isolated from prostasomes present in different biological fluids for the possible diagnosis of prostate cancer. For that purpose, a systematic search was conducted in PubMed to find proteomic studies regarding prostate cancer using terms such as extracellular vesicles, exosomes, prostasomes, blood, urine, and seminal fluid, among other biological samples.

1. INTRODUCCIÓN

El cáncer de próstata (CaP) es la se-gunda neoplasia más común en hombres [1]. Un estimado de 1,1 millones de varo-nes en todo el mundo fueron diagnostica-dos con CaP en 2012, así mismo, es la quinta causa de muerte asociada a cáncer en los hombres [2]. En nuestro país se diagnostican más de 6.500 casos nuevos y mueren más de 2.400 hombres anualmen-te [3].

El diagnóstico de CaP cuenta con dos pruebas de detección temprana, la medi-ción del Antígeno Prostático Específico (PSA) y el tacto rectal de la próstata [4]. El PSA es una proteína producida por la próstata cuya expresión aumentada pue-de obedecer a distintas causas, entre ellas Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), prostatitis [5], edad avanzada [6] y el CaP. A pesar de ser una prueba poco invasiva y sensible [7], presenta baja especificidad, lo cual conduce a falsos positivos para el diagnóstico, de hecho, la probabilidad de diagnosticar CaP en un paciente con PSA superior a 4ng/mL es del 21 %, lo que representa una «sobre valoración» del 75 %, y un «sobre diagnóstico» que oscila entre 30-50 % en una enfermedad tumoral que podría ser indolente [8]. Incluso al-gunos pacientes con CaP se caracterizan por tener bajos niveles de PSA. Con este panorama, en los últimos años se han reportado formas alternativas de la prue-ba de PSA que tienen un mejor rendi-miento, el Índice de Salud Prostática (PHI) es una nueva fórmula que combina las tres formas de PSA (PSA total, PSA libre y proPSA) en una única puntuación que puede ser utilizada para el diagnósti-co y manejo de CaP [9]. Un estudio re-ciente [10] demostró que los niveles de proPSA y el PHI pueden discriminar entre los pacientes con cáncer de próstata y los que tienen PHB o una inflamación crónica prostática, lo cual reduce la nece-sidad de biopsias innecesarias en un 27 % de los casos. Sin embargo, el PHI no es eficaz para la estratificación de los pa-cientes, y por lo tanto se ha continuado la búsqueda de mejores biomarcadores que puedan ser usados en el diagnóstico, pro-nóstico y seguimiento del CaP [10].

En cuanto al tacto rectal, se tiene que esta prueba genera incomodidad, ya que implica la exploración digital de la glán-dula a través del recto, además, solo per-mite palpar la cara anterior de la prósta-ta, por lo que resulta bastante ineficiente, se estima que del 23 al 45 % de los CaP se pasan por alto y aproximadamente el 50 % se diagnostican en una etapa avanzada [7]. Es por ello que el diagnóstico tem-prano para CaP resulta fallido en muchos casos. Por otro lado, otros marcadores como el codificado por el gen PCA3 (gen del antígeno tres en cáncer de próstata) que traduce para una proteína exclusiva del tumor prostático, la cual es detectada tanto en la orina como en el fluido prostá-tico de los pacientes han sido propuestos, aproximadamente el 95 % de los pacien-tes con CaP exhiben niveles de PCA3 en orina superiores al grupo control saluda-ble. En un par de estudios publicados analizaron la efectividad de este biomar-cador, en la detección del CaP en mues-tras de orina posterior a un masaje pros-tático, reportando una sensibilidad del 66 % y una especificidad del 89 % en el pri-mer estudio [11] y en el segundo un 74 % y 91 % de sensibilidad y especificidad respectivamente [12]. Estos resultados obtenidos, suscitaron interés en el desa-rrollo de una prueba en orina que pudiera estar disponible comercialmente.

El test PROGENSA-PCA3 se basa en la amplificación del ARNm de PCA3 en la orina medida por transcripción. El resul-tado se traduce en un puntaje que es va-lorado en el contexto clínico de cada pa-ciente. Esta prueba urinaria de PCA3 usada en conjunto con la prueba sérica de PSA incrementa el umbral de detección del CaP [13]. Hasta la fecha este es el único biomarcador de orina comercial-mente disponible, con ventajas claras como que el volumen de la próstata no afecta el resultado (como en el caso de la prueba sérica de PSA), e identifica aque-llos pacientes con alto riesgo de desarro-llar CaP y por ende mejora el diagnóstico reduciendo la necesidad de practicar biopsias innecesarias.

Los pacientes sospechosos para CaP por lo general deben someterse a biopsias de próstata en serie para la vigilancia activa. Sin embargo, el análisis histopato-lógico puede subestimar el grado o exten-sión de la enfermedad o incluso no permi-tir la observación del tejido tumoral, esto debido a la naturaleza multifocal y hete-rogeneidad de los tumores prostáticos [14]. Por lo tanto, se hace imperativa la búsqueda e implementación de marcado-res transportados por sangre, orina u otros líquidos corporales de fácil obten-ción, que permitan la detección temprana de la enfermedad con el fin de hacer la vigilancia activa del CaP, de manera me-nos invasiva, además de reducir costos en el sistema de salud y evitar complicacio-nes potenciales por el muestreo de tejido prostático a través de la biopsia transrec-tal.

Mediante estudios In vitro se demos-tró que todos los tipos de células huma-nas liberan vesículas extracelulares (VEs) y que por lo tanto es común observarlas en los diferentes fluidos corporales [15]. Diversas funciones han sido atribuidas a dichas VEs liberadas desde células nor-males, apoptóticas y necróticas, entre ellas, su participación en la comunicación intercelular, particularmente, en proce-sos de respuesta inmune adaptativa [16]. Adicionalmente, en la última década se ha descrito de manera detallada los me-canismos moleculares involucrados en la formación de las VEs y su composición química.

Los fluidos prostáticos contienen VEs de dos tipos, prostasomas y exosomas: los prostasomas (150-500 nm), son producidos por células epiteliales ductales prostáti-cas que son un componente normal del líquido seminal y juegan un papel en la fertilidad masculina; y exosomas, que son nanovesículas especializadas (30-100 nm) con una morfología en forma de copa, secretada activamente por una variedad de células normales y tumorales [16]. Se ha encontrado una gran cantidad de exo-somas en suero, orina y efusiones tumora-les de pacientes con cáncer [16].

Partiendo de que las VEs de las célu-las cancerosas tienen contenidos únicos y específicos del cáncer, junto con la obser-vación de que los prostasomas están pre-sentes tanto en la sangre como en la orina de los pacientes con CaP, surgió la hipó-tesis de que las VEs pueden proporcionar marcadores útiles para el CaP. Dicha idea fue respaldada por los primeros estudios en los que se compararon los perfiles de proteoma de VEs aisladas de cultivos de líneas celulares tumorales y no tumorales de próstata, en los cuales se identificaron múltiples proteínas que podrían consti-tuir posibles biomarcadores proteicos candidatos para CaP [17]. En este contex-to, el objetivo de esta revisión es presen-tar un estado del arte de los biomarcado-res proteicos para diagnóstico/pronóstico de CaP, aislados desde prostasomas y otras VEs. Los biomarcadores revisados son presentados en la Tabla 1, discrimi-nando las ventajas y desventajas de los estudios en los que se reportan y la posi-ble utilidad (ver Tabla 1).

Tabla 1. Proteínas asociadas a prostasomas propuestas como posibles marcadores para cáncer de próstata. Fuente: autores

2. METODOLOGÍA

3. PROSTASOMAS Y CAP

Los prostasomas fueron inicialmente caracterizados por Gunnar Ronquist a finales de 1970 [18]. La formación de los prostasomas se inicia desde una célula epitelial acinar de la próstata humana. Los prostasomas son enviados a la luz glandular por un evento exocitótico, que está precedido por la fusión con membra-nas adyacentes, también se puede ver que la vesícula de almacenamiento puede translocarse en su totalidad desde el interior de la célula hacia la luz acinar a través de la membrana plasmática, cuyo proceso se denomina como diacitosis. La vesícula de almacenamiento, corresponde a cuerpos multivesiculares de origen endosomal tardío [19] este proceso se representa en la Fig. 1.

Fig.1. Formación de las VEs-prostasomas. Vía celular por la cual los prostasomas se se-cretan en el espacio extracelular. 1) Las vesículas se endocitan desde la superficie de la célula. 2) Estas vesículas transitan al endosoma temprano donde las invaginaciones del endosoma crean vesículas internas, dando como resultado un endosoma multivesicular (MVE). 3) El MVE puede dirigirse a la superficie de la célula 4) o dirigirse al lisosoma maduro en la cual se digerirá (destruirá) el conte-nido de la vesícula. 5) Por último, si con-tinua con la ruta de la exocitosis pasa a fusionarse con la membrana plasmática liberando su contenido, que incluye las vesículas internas que se convierten en prostasomas cuando se secretan desde la célula. Fuente: Autores

Diferentes estudios mostraron que es-tos prostasomas poseen diversas funcio-nes fisiológicas, generalmente relaciona-das con las funciones de la célula paren-tal, tienen la capacidad de llevar molécu-las como lípidos o proteínas a los esper-matozoides durante su viaje al ovocito, y poseen funciones tales como: actuar como mensajeros intercelulares entre las célu-las secretoras de la próstata y las células espermáticas, ser una especie de «reser-vorio» que los espermatozoides pueden usar dependiendo de las condiciones del entorno [18], actuar en la regulación de la capacitación de las células espermáticas que se denomina como el proceso en el cual los espermatozoides alcanzan la ca-pacidad de unirse a la zona pelúcida del ovocito, experimentan la reacción acro-sómica y adquieren motilidad hiperactiva; esta motilidad hiperactivada es necesaria para que las células espermáticas se des-prendan del epitelio oviductal, naden a través del moco allí presente y pasen la capa de células foliculares que rodean al ovocito, penetrando así la zona pelúcida, lo que conlleva a una correcta fertiliza-ción [15]. Aparte de los prostasomas, otros epitelios del tracto reproductor masculino también liberan VEs que se mezclan con prostasomas verdaderos durante la emisión de semen [15], como el epitelio epididimal que produce VEs, que se cree que son eliminadas de la membra-na plasmática de forma apocrina. Estas vesículas posteriormente se fusionan con la membrana plasmática espermática permitiendo la trasferencia de subconjun-tos específicos de membrana y proteínas citosólicas a las células espermáticas.

El contenido proteico de los prosta-somas es amplio; en un estudio realizado por Utleg et al, [20], donde se recolecta-ron muestras del eyaculado de 5 volunta-rios sanos y se asilaron los prostasomas para la posterior caracterización de su proteoma, mediante shotgun Proteomics, identificaron un total de 139 proteínas, de las cuales 128 no habían sido descritas previamente como constituyentes prosta-somales. Es importante mencionar que muchas de las proteínas reportadas en ese estudio son reguladas por andróge-nos, tales como PSA, serina proteasa transmembrana tipo 2 (TMPRSS2), trans-glutaminasa específica de próstata, asi-mismo, algunas de ellas resultan muy específicas de la próstata de expresión abundante en este tejido, como PAP y antígeno prostático de células madre (PSCA) [15].

Las células tumorales y metastásicas de CaP pobremente diferenciadas tienen la capacidad de sintetizar y exportar ma-yor concentración de prostasomas, ya que la arquitectura de tejido se altera durante el proceso de carcinogénesis favoreciendo la liberación de prostasomas al espacio intersticial. Además, se conoce que las células tumorales tienden a explotar los sistemas fisiológicos del huésped con el fin de obtener apoyo en términos de, nu-trición, crecimiento y metástasis. Parece que varias habilidades prostasomales, que se desarrollan para ayudar a las células espermáticas en la fertilización, también pueden ser promotoras en la transición de una célula normal a una neoplásica y ayudar a las células cancerígenas, mal diferenciadas, a sobrevivir y hacer metás-tasis [21].

4. PROSTASOMAS EN FLUIDO SANGUÍNEO

El concepto general de que los exoso-mas aislados de la sangre puedan servir como posibles biomarcadores para la de-tección del cáncer fue recientemente ratificado para el cáncer de páncreas, ya que en este modelo se identificó que los exosomas de las células tumorales tienen contenidos específicos y únicos para el cáncer [22].

Como se mencionó anteriormente, las VEs secretadas por la membrana se desa-rrollan inicialmente dentro de los endo-somas multivesiculares intracelulares, durante este proceso, proteínas y ácidos nucleicos son encapsulados en los exoso-mas. Una vez se da la liberación en el espacio extracelular, dichas VEs entran en la circulación [17]. Particularmente, en CaP debido a la pérdida de la polaridad celular, lo cual favorece la liberación de los prostasomas al espacio intersticial y en consecuencia a la circulación [23], ge-nerando la posibilidad de aislarlos desde sangre para su posterior estudio.

Varios biomarcadores moleculares de-rivados de la sangre para la detección del CaP han estado disponibles a lo largo de los años [24]. Sin embargo, debido a su baja especificidad/sensibilidad y a lo pro-metedor que pueden ser los prostasomas como posibles biomarcadores, se han rea-lizado estudios con estas vesículas, los primeros intentos para demostrar la pre-sencia de prostasomas en la sangre de un paciente con CaP, se centraron en la de-tección de anticuerpos anti-prostasomas, ya que los prostasomas pueden estimular el sistema inmune induciendo la produc-ción de autoanticuerpos, que pueden ser detectables en sangre de pacientes con CaP, sin embargo, estos anticuerpos anti-prostasomas son pocos específicos y ade-más no permiten estratificar el CaP [25].

Sin embargo, se debe considerar que en el fluido sanguíneo no solo se encuen-tran prostasomas, si no también otras VEs que son secretadas activamente por la mayoría, sino todas, las células nuclea-das, generando así una contaminación y por consecuencia convierte el proceso de aislamiento de los prostasomas en un procedimiento complicado [17]. En un estudio realizado por Tavoosidana, et al, [23], donde propusieron una metodología para el aislamiento de los prostasomas, en la que la detección de estas microvesí-culas multiproteícas depende del recono-cimiento simultáneo de cinco epítopes diferentes en al menos cuatro proteínas, aminopeptidasa N (CD13) y factor tisular (CD142), una glicoproteína asociada a la membrana celular que sirve como recep-tor y cofactor esencial para los factores VII y VIIa de la cascada de coagulación , mediante el uso de anticuerpos mono o policlonales diferentes, de manera que para detectar la suficiencia de los prosta-somas en el plasma sanguíneo de pacien-tes con CaP, realizan una modificación en el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), el cual es un mecanismo para la detección sensible y especifica de proteí-nas en el que las moléculas de interés deben ser reconocidas por anticuerpos [26] y posteriormente cuantificadas me-diante PCR en tiempo real.

El plasma sanguíneo fue recolectado de dos grupos de pacientes con CaP y sujetos controles, pareados por edad: el primer grupo incluyó muestras de 20 pacientes con un PSA de 94-2706 ng/ml y 20 controles con niveles de PSA inferiores a 2.5 ng/ml. El segundo grupo estaba constituido por 59 pacientes con CaP y un PSA de 1.1 a 39.1 ng/ml y se compararon con 20 controles con un PSA entre 1.7–14.8 ng/ml con resultados benignos de biopsia transrectal. Se detectaron niveles de prostasomas relevantes en las mues-tras de sangre de los pacientes con CaP, hasta 7 veces más altos en comparación con las 20 muestras de los sujetos contro-les [23].

Al usar este ensayo, se demuestra con éxito que los prostasomas se pueden de-tectar en niveles elevados en el plasma sanguíneo de pacientes con CaP, además los resultados también muestran que este análisis puede distinguir pacientes con puntajes de Gleason medio y alto de aque-llos puntajes bajos, lo que permite corre-lacionar la agresividad del tumor. En conclusión, debido a su alta sensibilidad y especificidad para prostasomas en mues-tras de sangre, el ensayo realizado en este estudio es prometedor como un pro-cedimiento para el aislamiento de estas vesículas, sin embargo, se deben conti-nuar con los experimentos [23].

Por otro lado, la proteína antiapoptó-tica Survivin pertenece a una familia conocida de oncoproteínas, aislada de vesículas exosómicas derivadas de la sangre, expresada en la mayoría de tumo-res malignos [27], razón por la cual ha sido estudiada como posible biomarcador en distintos tipos de cáncer, entre ellos CaP. En un estudio realizado en muestras de sangre de pacientes afroamericanos con CaP reportaron un aumento significa-tivo de esta proteína, en comparación de hombres pertenecientes a otros grupos raciales y a los sujetos controles [28]. Es necesario resaltar que el CaP suele ser más agresivo en afroamericanos que en varones de otros grupos étnicos; con este hallazgo se describen diferencias signifi-cativas en la biología tumoral de CaP entre grupos étnicos. Particularmente, los autores proponen que el aumento de la expresión de Survivina en VEs de pa-cientes afroamericanos con CaP puede influir en la agresividad del tumor y con-tribuir con la tasa de mortalidad observa-da en esta población [28]. Esta proteína podría servir como nuevo biomarcador y posible blanco terapéutico que podría tener utilidad clínica para mejorar la salud de pacientes con CaP, ya que se ha demostrado que la Survivin se encuentra extracelularmente y está contenida en los exosomas [29], además que también se expresa en el CaP y su regulación sensibi-liza las células del cáncer a los agentes quimioterapéuticos. Khan et al realizan un estudio utilizando [30] la técnica de ELISA y Western Blot respectivamente, para investigar la existencia de Survivina exosomal en el plasma de pacientes con CaP con una variedad de presentaciones de este y comparar la expresión de sus niveles en los exosomas encontrados en los sujetos controles y pacientes con Hi-perplasia Prostática Benigna (HPB). Para ello, obtienen muestras de plasma san-guíneo de 10 voluntarios sanos y 28 mues-tras de pacientes con CaP, se selecciona-ron 10 muestras de bajo grado (Gleason 6) y 10 de alto grado (Gleason 9); además, recolectaron muestras de 8 pacientes con la enfermedad avanzada que participaban en quimioterapia y 20 muestras de pa-cientes con HPB. En sus hallazgos, la Survivina fue detectable en todos los sujetos controles, pacientes con CaP y HPB, sin embargo, sus resultados fueron diferentes para todos los casos, se encon-tró altamente expresada en los exosomas de pacientes con CaP que presentaban puntajes de Gleason de 6 y 9, y en pacien-tes que habían recaído en la quimiotera-pia. No obstante, no hubo diferencias significativas en los niveles de Survivina entre los sujetos con puntuaciones de Gleason bajas o altas. Además, aunque los pacientes con HPB también contienen en sus exosomas Survivina, el nivel de ex-presión fue significativamente bajo en comparación con los hallados en pacien-tes con CaP. En conclusión, este estudio demuestra que los niveles plasmáticos de Survivina exosómica puede ser una he-rramienta para el diagnóstico o monitori-zación del CaP [30].

Como el contenido del exosoma refleja su fuente celular, estos pueden contener proteínas oncogénicas o proteínas supre-soras de tumores, por lo tanto, puede conducir a efectos positivos o negativos en relación con la progresión del cáncer. En esta investigación, realizada por Ga-briel et al., en el 2013, se recolectan 30 muestras de pacientes con CaP en un estadio avanzado (T3 / T4) y antes de la prostatectomía, además de 8 hombres voluntarios sanos de 50 y 65 años de edad [31]. El CaP agresivo o metastásico se asocia con una reducción o pérdida de la expresión de PTEN, una potente proteína supresora de tumores, para lo cual los resultados es este estudio realizados por inmunotransferencia revelan una incor-poración de PTEN en los exosomas que circulan en sangre de pacientes con CaP, pero, curiosamente, los sujetos sanos no muestran esta expresión en sus exosomas sanguíneos. Los resultados de este estu-dio mostraron un nuevo mecanismo por el cual las células cancerosas regulan la expresión de PTEN a través de exosomas; todo esto lleva a la conclusión de que la expresión de PTEN en los exosomas es una característica exclusiva de las células tumorales, además el estado de PTEN en pacientes con CaP podría ser un posible predictor del riesgo de metástasis o reaparición después de la prostatectomía. Sin embargo, se requieren mayores estu-dios para aprobar estos hallazgos [31].

Los microRNA extracelulares incrus-tados en exosomas circulantes pueden servir como biomarcadores pronósticos en el cáncer. En una investigación realizada por Huang et al en el año 2015, realizaron una secuenciación de RNA para identifi-car miRNA exosomal en 50 candidatos sanos y 36 pacientes con CaP, de los cua-les 23 pacientes eran resistentes a la castración (CRPC). Los miRNA se evalua-ron mediante la técnica de PCR en tiem-po real. El estudio identificó dos candida-tos de miRNA (miR-1290 y miR-375), sin embargo, los miR -375 asociados con el cáncer han sido implicados en una varie-dad de carcinomas, incluidos el CaP, la regulación de este se ha correlacionado con la metástasis del CaP, pero también con la supervivencia de pacientes con cáncer esofágico; por otro lado, los miR-1290 tuvieron una mejor predicción en los resultados en comparación con miR-375, sin embargo, sus expresión aumentada en suero discrimina para el cáncer de pán-creas en estadio bajo y también está invo-lucrado en el cáncer de mama, en conse-cuencia su papel directo para el CaP permanece indeterminado. No obstante, en esta investigación observaron ciertas diferencias significativas en los resulta-dos que sugieren los miRNA exosomales circundantes como posibles biomarcado-res sensibles para el pronóstico de pa-cientes con CRPC [<cr n="33">33</cr ].

En otro estudio realizado por Bryant et al [33] se planteó analizar los cambios en los microRNA (miR) circulantes como posibles biomarcadores para el diagnósti-co, la estratificación y predicción del CaP, para ello recolectaron 78 muestras de plasma sanguíneo de pacientes con CaP (12 sin metástasis, 51 M0 y 15 M1) y 28 de individuos control (PSA >10 ng/ml), y por medio de la técnica de PCR en tiempo real analizan 742 miRs utilizando las microvesículas circulantes (cMV). En sus resultados obtuvieron un total de 12 miR que se cuantificaron diferencialmente, de los cuales 11 aumentaron significativa-mente en las cMV de los pacientes con CaP en comparación con las muestras control, mientras que la concentración de miR-181a -2 obtuvo una reducción. Poste-riormente, analizan los cMV de 55 pacien-tes con CaP no metastásico para el cual identifican 10 miRs cuantificados diferen-cialmente, 9 miR señalan un aumento significativo mientras que miR- 181a -2 expresa una disminución. Luego compa-ran los perfiles de miR en 16 pacientes con metástasis y 55 con CaP no metastá-sico, donde encuentran un total de 16 miR cuantificados diferencialmente en pacien-tes con CaP metastásico en comparación con aquellos que poseen la enfermedad no metastásica; 15 miRs señalan una concen-tración mayor, mientras que miR-572 se expresó significativamente menor en varones con CaP metastásico frente al no metastásico. Esto lleva a la conclusión de que los cambios en las concentraciones de miR en pacientes con CaP pueden ser utilizados para el hallazgo del diagnóstico y para la estratificación del mismo [33].

Las células cancerígenas producen grandes cantidades de VEs, por lo que se ha propuesto que los exosomas tumorales influyen en la respuesta inmune y posi-blemente contribuyen a la progresión del cáncer [34]. En una investigación realiza-da por Lundholm et al, [35] analizan en pacientes CRPC (pacientes con CaP resis-tentes a la castración) la capacidad de los exosomas derivados de células tumorales para regular negativamente la expresión de NKG2D el cual es un receptor de cito-toxicidad que se expresa por una varie-dad de células inmunes, incluyendo las células NK, células NKT, CD8 y células T; su perdida en el cáncer es significativa-mente importante en la supresión inmu-ne. Recolectan 18 muestras de sangre de pacientes con CRPC antes del inicio del tratamiento con quimioterapia y 8 mues-tras de sujetos sanos; usando la citome-tría de flujo, encuentran que los linfocitos circulantes de pacientes con CRPC ex-presan reducción de NKG2D además los exosomas derivados del tumor indujeron la regulación negativa de NKG2D en célu-las T, NK y CD8 en comparación con los resultados de las muestras control. De acuerdo con estos hallazgos, la secreción de exosomas puede ser un mecanismo de escape inmune del tumor en la CaP [35].

5. PROSTASOMAS EN ORINA

La orina es un fluido de desecho cor-poral que se puede obtener fácilmente, por lo que es ideal para la determinación y el análisis de biomarcadores. Esta es una mezcla compleja de proteínas, sales, urea y metabolitos filtrados y secretados que pueden variar, no solo en situaciones fisiológicas, sino especialmente en enfer-medades que afecten el sistema genitou-rinario [36].

En la actualidad, se sabe que hay pre-sencia de prostasomas en fracciones de VEs aisladas de la orina mediante la de-tección de proteínas específicas de la próstata, entre las que se destacan el antígeno prostático específico de mem-brana (PSMA), la fosfatasa acida prostáti-ca y la trasglutaminasa prostática [17].

La orina contiene células tumorales prostáticas intactas y cuerpos apoptóticos derivados de dichas células. Las células y la mayoría de los cuerpos apoptóticos son considerablemente más grandes que los prostasomas, por lo tanto, pueden sepa-rarse fácilmente de estos mediante cen-trifugación diferencial [37], por esta razón la orina es una fuente importante para el estudio de biomarcadores asociados a prostasomas.

A pesar de que distintos tejidos dentro del sistema genitourinario masculino, como el renal, testicular, entre otros [38], contribuyen con las VEs encontradas en la orina, una ventaja particular de traba-jar con este fluido como fuente de biomar-cadores, es que frecuentemente se obser-va enriquecido en prostasomas. Proba-blemente, debido a las funciones especia-les que tienen los prostasomas en la tu-morogénesis del CaP, la angiogénesis y la evasión de la respuesta inmune [36].

En un estudio [4] donde se analizó el proteoma de los exosomas urinarios, me-diante la técnica de espectrometría de masas, con el objetivo de identificar pro-teínas expresadas diferencialmente en pacientes con CaP en comparación con controles sanos; se aislaron los exosomas urinarios de 15 muestras control y 17 muestras de pacientes con CaP, cuyo análisis reveló 246 proteínas diferencial-mente expresadas en los dos grupos, de las cuales 221 se encontraban sobreexpre-sadas en CaP. Particularmente, 37 de estas proteínas fueron seleccionadas con criterios específicos, tales como la sensi-bilidad, especificidad y veces de cambio en la expresión. Estas 37 proteínas juntas presentaban una especificidad del 100 %. 17 de estas mostraron sensibilidades individuales superiores al 60 %. Aunque varias proteínas mostraron alta sensibili-dad y especificidad para el CaP como biomarcadores individuales, combinándo-las en una única prueba tiene el potencial para la diferenciación total del CaP con-tra los controles sanos. La mayor sensibi-lidad, 94 % (16 de 17 pacientes), se obser-vó para la proteína transmembrana 256 (TM256). Asimismo, el complejo proteico LAMTOR también presentó muy alta especificidad en muestras de CaP. Estos resultados permiten demostrar el poten-cial uso de los exosomas urinarios en el diagnóstico y manejo clínico del CaP.

Otro estudio [16], donde se analizaron los exosomas urinarios de 9 pacientes con CaP dividiéndolos en los cuatro grupos siguientes: recién diagnosticados sin pre-vio tratamiento, diagnosticados, bajo te-rapia de privación de andrógenos (ADT) y pacientes con metástasis óseas verifica-das; a partir de una cantidad muy limita-da de ARN exosómico y por medio de una PCR anidada lograron confirmar la pre-sencia de dos conocidos biomarcadores de CaP; PCA-3 y TMPRSS2:ERG. Las trans-cripciones de ARNm para el gen de fusión TMPRSS2: ERG se detectaron en los pacien-tes que tenían una puntuación de Gleason alta y altos niveles de PSA, y no en los pacientes con tumores de bajo riesgo, mientras que las transcripciones de PCA -3 se detectaron en todos los pacientes después de un masaje de próstata leve. Este estudio demostró que al incluir mRNAs y miRNAs exosómicos para la búsqueda de biomarcadores, no solo se contribuye con la detección de cáncer, sino también con la clasificación de la severidad del fenotipo tumoral y la res-puesta al tratamiento.

Actualmente, se han identificado aproximadamente 1000 miRNAs en hu-manos y cada uno de ellos puede estar relacionado o apuntar a genes que influ-yen en vías de señalización importantes para la progresión de varios tipos de cán-cer. Se ha comprobado que varios miRNA tienen su función alterada o se encuen-tran diferencialmente presentes en el CaP y parecen influir en la actividad an-tiapoptótica [33].

En un estudio poblacional [33] donde se recogieron muestras de orina de 135 hombres posterior a un masaje prostático transrectal, se analizaron cinco miRNA seleccionados por medio de PCR-TR y se descubrió que miRNA-107 y miRNA-574-3P se sobreexpresaron significativamente en la orina de pacientes con CaP en com-paración con los controles; ambos miR-NAs podían identificar la presencia de CaP a partir de muestras de orina (índi-ces de concordancia 0.66-0.74) y parecían más precisos que el PCA3 normalizado para el PSA urinario (índice de concor-dancia 0.61) lo cual nos deja como obser-vación que un ensayo individual del nivel de concentración de miR-107, por ejem-plo, puede ser una prueba de diagnóstico clínicamente útil para el CaP no metastá-sico.

6. LÍQUIDO SEMINAL

El Fluido Seminal (FS) está compuesto por altas concentraciones de proteínas, iones solubles y moléculas pequeñas, aproximadamente el 40 % del FS es mate-rial prostático, liberado después de la eyaculación [4].

El FS tiene una serie de ventajas so-bre la sangre y la orina en términos de su potencial como fuente de biomarcadores específicos de CaP. En primer lugar, los constituyentes prostáticos están altamen-te enriquecidos en el FS en comparación con otros fluidos corporales. De hecho, el PSA se describió originalmente en FS, donde existe una concentración de apro-ximadamente 5-6 órdenes de magnitud mayor que en el suero sanguíneo. En se-gundo lugar, a diferencia de las células epiteliales prostáticas malignas y sus productos que solo ingresan a la circula-ción tras la trasgresión de las barreras del tejido sanguíneo, las células y sus secreciones se liberan de forma natural en el FS, tanto en las glándulas normales como en las malignas. Ambos factores sugieren que los biomarcadores se detec-tarían en FS antes que, en sangre, lo que destaca el potencial de este líquido para la detección temprana, incluidos los cam-bios premalignos. En tercer lugar, el FS no solo contiene material libre de células de la próstata, sino también células tumo-rales detectables antes del diagnóstico de CaP basado en la biopsia, con la tasa de proliferación de estas células potencial-mente valiosa en el control de pacientes con enfermedad de bajo grado en regíme-nes de vigilancia. [41]

Debido a que el FS es un medio mole-cular diverso y abundante, compuesto por ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, azú-cares, pequeños metabolitos e iones [42], permite que sea un candidato para la búsqueda de prostasomas como biomar-cadores para el CaP. En los últimos años se han realizado intentos con diferentes técnicas para la identificación de biomar-cadores específicos de CaP. Recientemen-te en un estudio realizado por Carlsson et al, proceden al aislamiento de prostaso-mas para hacer una comparación entre las características funcionales y bioquími-cas entre tres de estos de diferentes fuen-tes, entre ellas de líquido seminal. La muestra de semen se centrifugó durante 20 minutos para separar los espermato-zoides y otras posibles células del plasma seminal, que luego se agruparon en 15 muestras, la citometría de flujo y ELISA fueron algunas de las técnicas utilizadas en esta investigación, para revelar que fuertes similitudes entre los prostasomas aislados de los tres tipos de muestras; una porción alta de algunas enzimas, colesterol y fosfolípidos fueron caracte-rísticas comunes, además, las proteínas de membrana CD13, CD26, CD10 y CD46, previamente asociadas con el plasma seminal (SP), se encontrar en los tres tipos de prostasomas, asimismo, CD13 y DPPIV mostraron una concentración extremadamente mayor en este fluido. Estos resultados señalan que es posible encontrar prostasomas en diferentes fuentes, siendo SP bastante prometedor para futuras investigaciones en prosta-somas [43].

Como se ha mencionado, los prosta-somas cumplen una función en la regula-ción de los espermatozoides, la inmuno-supresión y la progresión del CaP. Galectin-3 es una proteína de unión a carbohidratos multifuncional que se caracterizó inicialmente como un sustrato proteolítico para el PSA y se demostró que se asociaba con prostasomas en el semen humano [44], además participa en la inmunomodulación, interacciones celu-lares y en la progresión del cáncer, in-cluido el CaP [45]. En esta investigación realizada por Block et al, los ligandos galectin-3 candidatos en prostasomas se identificaron mediante espectrometría de masas, además, también se usaron otros métodos inmunoquímicos y bioquímicos para investigar la asociación de la proteí-na de unión Mac-2 (M2BP) con prostaso-mas. Cabe mencionar que la molécula de galectina-3 ejerce sus funciones mediante interacciones proteína-carbohidrato con ligandos glicoconjugados, estas interac-ciones se entrecruzan y generan ligandos que se unen a galectina-3 para inducir efectos posteriores [45]. Se obtuvo mues-tras de semen para realizar el aislamien-to de los prostasomas, para lo cual los ligandos de unión a galectina 3 identifi-cados en los resultados incluyen M2BP, CD26, PIP, peptidasa IV, olfactomedina-4 (OLF4) y seminogelinas I y II; M2BP se encontró en la superficie del prostasoma y en los espermatozoides. Los estudios indicaron que M2BP es de alta importan-cia funcional con los prostasomas, lo que siembra una base para investigaciones futuras sobre la progresión del CaP res-pectivamente [45].

En otro estudio publicado por MJ et al, donde estudiaron la precisión pronós-tica o diagnóstica para el CaP por medio del FS, se analizan una cohorte de mues-tras de 152 hombres sospechosos de tener CaP por los resultados iniciales de un PSA aumentado y/o un tacto rectal anor-mal; los pacientes se clasificaron en dos grupos: alto riesgo y bajo riesgo [46]. Se evaluó la precisión diagnóstica de PCA3, un RNA no codificante asociado a CaP y Hepsin, una proteasa transmembrana previamente asociada con CaP. Una com-binación de Hepsin, PCA3 y PSA sérico mejora la predicción del estado del CaP y el riesgo clínico con mayor precisión que el PSA sérico solo. Además, la integración de los marcadores de miRNA con PCA3 y Hepsin mejoró aún más la especificidad diagnóstica y la predicción del riesgo [46].

En una nueva investigación realizada por Dubois et al, primeramente, se reco-lecta plasma seminal de 48 varones con CaP para evaluar la expresión de proteí-nas de chromogranin (cg) en prostasomas y VEs de células malignas de la próstata. Por medio de la técnica de ELISA se ob-servaron patrones divergentes de pépti-dos de chromogranin al comparar prosta-somas y VEs, lo que indican un cambio fenotípico [47]. El estudio demostró un mosaico de péptidos pertenecientes a miembros clásicos de la familia de proteí-nas de graninas en la superficie no solo de prostasomas sino también de VEs, además la expresión de los prostasomas difería significativamente del hallado en las VEs. Por lo tanto, se llega a la conclu-sión de que los péptidos de cgA serían detectables preferiblemente en prosta-somas provenientes de células no malig-nas, mientras que los péptidos cgB se detectaron más fácilmente en las VEs de células malignas; estas Cromogranina no solo de prostasomas sino también de VEs derivadas del CaP pueden ser de gran importancia para el diseño de nuevos ensayos sobre el grado de malignidad del CaP [47].

Las propiedades del CaP cambian drásticamente cuando las células se vuel-ven independientes de andrógenos y se produce la metástasis. Se ha revelado que estas células metastásicas del CaP pue-den producir prostasomas y exportarlas al espacio extracelular; por lo tanto, se cree que los prostasomas producidos por las propias células de CaP son los princi-pales actores en el proceso maligno y que la resistencia contra el sistema inmune es una característica central en el proceso de selección [48]. En el estudio realizado por Babiker et al, investigaron la expre-sión y la función de las proteínas quinasas prostasómicas y la ATPasa, para lo cual cultivan líneas celulares de CaP y tam-bién aíslan prostasomas de 30 muestras de líquido seminal de hombres remitidos a la clínica de fertilidad en el Hospital Universitario de Uppsala; las funciones de la proteína quinasa en prostasomas aislados se analizaron mediante la fosfori-lación de sustratos, también se evalúa la actividad de la ATPasa, además utilizan la citometría de flujo para verificar estas expresiones. Los resultados de esta in-vestigación demuestran que todos los prostasomas de origen celular poseen actividad significativamente superior de proteína quinasa en comparación con los seminales, lo que resulta en una mayor fosforilación, tanto de sustratos exógenos como endógenos. También se encontró que las prostasomas de origen metastási-co tenían una actividad de ATPasa más baja, además, el componente C3 y el fibri-nógeno (dos proteínas cuyas actividades están moduladas por la fosforilación) obtuvieron una expresión relevante en la fosforilación. Si la sobreexpresión de proteínas quinasas en las células de CaP metastásicas se pudiera controlar o con-trarrestar, podría potenciar otros tipos de inmunoterapia, todos estos resultados llevan a la búsqueda de nuevos objetivos para la intervención farmacéutica de pacientes con CaP [48].

7. OTRAS FUENTES ASOCIADAS A PROSTASOMAS

Existen otras fuentes como posibles biomarcadores asociadas a prostasomas, se conoce que las vesículas extracelulares además de estar circulando en diferentes fluidos corporales, poseen diferentes moléculas, entre ellas RNA [38]. Estas VE realizan acciones biológicas en lugares distantes de su origen, interactúan con otras células por diferentes mecanismos como la unión de receptores en la mem-brana celular desencadenando vías de señalización intracelulares y liberando así su contenido [49].

Debido a que las VE son valiosas he-rramientas para la detección, el pronósti-co y tratamiento del cáncer, se realizó el análisis de microvesículas liberadas al entorno extracelular utilizando líneas celulares del CaP metastásico PC-3, por medio de dos técnicas, la cromatografía líquida nanocapilar y espectrometría de masas; lograron identificar 266 proteínas con secuencias peptídicas, debido a que varias de estas proteínas se han identifi-cado anteriormente en exosomas, esto indica que las vesículas PC-3 tienen ca-racterísticas en común [49].

En particular, se mostraron tres pro-teínas de interés, CDCP1, la tetraspanin CD151 y CD147, además de otras proteí-nas como la TCTP y la neuropilina, todas estas asociadas y / o desreguladas en el CaP; por otro lado, fue muy relevante encontrar niveles abundantes de vinculi-na (proteína de la familia actina involu-crada en la interacción entre el citoesque-leto y la matriz extracelular) en las mi-crovesículas de PC-3. Esta última parece ser un biomarcador prometedor ya que su expresión se asocia con el aumento de la proliferación de las células tumorales en el CaP [49].

La Vigilancia Activa (VA) del CaP en estadio temprano se ha venido implemen-tando en la última década, ya que el diag-nóstico temprano y el tratamiento curati-vo contribuyen con la supervivencia de hombres con cánceres de riesgo desfavo-rable, sin embargo, existen preocupacio-nes significativas con respecto al sobre-diagnóstico y el sobretratamiento de hombres con CaP de riesgo menor. Aun-que las cohortes de VA publicadas difie-ren según el protocolo utilizado, las tasas de metástasis de la enfermedad y la mor-talidad específica por CaP son extrema-damente bajas en el mediano plazo (5-10años). Tales resultados parecen estar estrechamente relacionados con los crite-rios específicos del programa para la selección, monitoreo e intervención, sugi-riendo que la VA al igual que otras estra-tegias de manejo podrían ser más eficien-tes para la correcta estratificación de pacientes con CaP. Con el fin de refinar la estratificación del riesgo, el monitoreo individual a través de biomarcadores específicos podrían ser una opción, si estos marcadores son de tipo circulantes, se evade la desventaja asociada al sub-muestreo inherente a la biopsia prostáti-ca [50], [51].

Ya que algunos estudios han sugerido los prostasomas como posibles indicado-res de la progresión del cáncer, se encon-tró que Caveolina (Cav-1) es una proteína de membrana que se unen fuertemente al colesterol, su expresión aumentada está acompañada por la adquisición de fenoti-po de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en las células cancerígenas de la próstata [52]. Debido a que el CaP tam-bién es resistente a una amplia gama de agentes antineoplásicos, se ha observado en un estudio realizado por Pellinen et al, en 435 muestras de tejido prostático to-madas a pacientes con grados primarios y secundarios de la escala de Gleason, que Cav-1 en prostasomas de células tumora-les de CaP junto con CD59, como un mar-cador específico de estas vesículas, refle-jan prometedores resultados, Cav-1 con-dujo a la detención del crecimiento y la inhibición de la invasión celular en líneas celulares de CaP lo cual podrían servir como diagnostico o pronostico del CaP además de evaluar su progresión en pa-cientes que ya padezcan la enfermedad [52].

En otro estudio realizado en tres lí-neas celulares de próstata (normal, an-drógeno-sensible y andrógeno-independiente) derivadas de metástasis a ganglios linfáticos y hueso, respectiva-mente, con el fin de comprender su posi-ble papel en la quimiorresistencia al CaP, se muestra que la proteína de resistencia Multirresistente 1 (MRP1) se encuentra en fracciones de balsa lipídica de células tumorales y que el número de caveolas aumenta con la adquisición de maligni-dad. MRP1 no solo se encontró en la membrana plasmática asociada con las balsas lipídicas sino también en las acu-mulaciones citoplásmicas que se localizan con los marcadores de prostasoma Ca-veolin-1 y CD59 [53]. Debido a que las tres líneas celulares mostraron prosta-somas y que existe presencia de MRP1 en estos, los prostasomas podrían servir como un predictor de malignidad en CaP. Además, se llegó a la conclusión que tal vez haya dos poblaciones diferentes de células, aquellas menos agresivas que no expresa MRP1 en prostasomas y aquellas que tienen MRP1 en prostasomas locali-zado siendo estas más agresivas. Se pue-de concluir que tanto CD59 como Cav-1 podrían actuar como marcadores de pros-tasoma cuando las células adquieren ma-lignidad y que las células cancerosas que tienen más prostasomas tendrían menos MRP1 en la membrana plasmática [53].

Debido a la transferencia de material envuelto en microvesículas desde la célu-las tumorales a las células normales, se realizó un estudio con el objetivo de iden-tificar la expresión de los genes específi-cos de la próstata en células normales de médula cultivadas con células de CaP [54]. Se recolectaron 11 tejidos de pacien-tes con CaP, 1 normal y muestras de me-dula ósea de voluntarios sanos; los resul-tados arrojan una expresión génica signi-ficativamente aumentada, se encontró que las microvesículas del CaP podrían entrar en monocitos circulantes, células madre u otras células, logrando así alte-rar el fenotipo de una célula del CaP. Todo esto representa una oportunidad para nuevas estrategias terapéuticas, tales como anticuerpos, para bloquear la liberación de microvesículas de células cancerosas [54].

8. CONCLUSIONES

La poca especificidad y sensibilidad del PSA como marcador diagnóstico para el CaP ha llevado a la comunidad científi-ca a una intensa búsqueda de nuevos bio-marcadores en fuentes biológicas como la orina, la sangre, fluidos prostáticos y otros. La composición molecular de las vesículas extracelulares propias de la próstata ha revelado proteínas como po-sibles candidatas a biomarcadores para el diagnóstico, estratificación y pronóstico del CaP. El desarrollo de estos marcado-res requiere el análisis en grandes cohor-tes de pacientes, además, de aumentar la pureza de los aislamientos de los prosta-somas contribuyentes en sangre, orina o fluidos prostáticos.

Una ventaja de los prostasomas mues-treados a partir de sangre u orina es que representan el estado general del orga-nismo y el desarrollo del CaP, además de ser mínimamente invasivos.

La composición molecular de los pros-tasomas como proteínas y moléculas de ARN, entre otras, y la capacidad de estos de ser estables y que el ARN dentro de su lumen pueda resistir la ARNasa exógena, proporciona la capacidad para influir en el desarrollo y la metástasis del CaP. Por lo tanto, los prostasomas pueden conside-rarse abundantes en posibles marcadores para el diagnóstico/pronóstico del cáncer de próstata y servir como lectura para el estado de sus células de origen.

Sin embargo, las moléculas asociadas con prostasomas ya identificadas deben probarse en estudios de cohortes mayores de pacientes, para determinar su especi-ficidad y sensibilidad en el diagnóstico de CaP; de igual manera, se debe ampliar el campo de investigación en metodologías más eficientes para el aislamiento de los prostasomas en los distintos fluidos bio-lógicos, para su posterior estudio en es-tos, ya que esta es una de las principales debilidades que los prostasomas tienen.

9. AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la financiación otorgada por el Instituto Tecnológico Metropoli-tano, a través del proyecto de investiga-ción P10240.

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